Por Pieter Borger et al
Publicado pela primeira vez em 16 de dezembro
de 2020
Abstrato
Na publicação intitulada “Detecção do novo
coronavírus 2019 (2019-nCoV) por RT-PCR em tempo real” (Eurosurveillance 25(8)
2020), os autores apresentam um fluxo de trabalho de diagnóstico e protocolo
RT-qPCR para detecção e diagnóstico de 2019-nCoV (agora conhecido como
SARS-CoV-2), que afirmam ser validado, além de ser uma metodologia de
diagnóstico robusta para uso em ambientes laboratoriais de saúde pública.
À luz de todas as consequências decorrentes
desta publicação para as sociedades em todo o mundo, um grupo de pesquisadores
independentes realizou uma revisão ponto a ponto da referida publicação em que
1) todos os componentes do desenho de teste apresentado foram cruzados, 2) o As
recomendações do protocolo RT-qPCR foram avaliadas de acordo com as boas
práticas de laboratório e 3) parâmetros examinados em relação à literatura
científica relevante que cobre o campo.
O protocolo RT-qPCR publicado para detecção e
diagnóstico de 2019-nCoV e o manuscrito sofrem de vários erros técnicos e
científicos, incluindo design de primer insuficiente, um protocolo RT-qPCR
problemático e insuficiente e a ausência de uma validação de teste
precisa. Nem o teste apresentado nem o próprio manuscrito preenchem os
requisitos para uma publicação científica aceitável. Além disso, sérios
conflitos de interesse dos autores não são mencionados. Finalmente, o
prazo muito curto entre a submissão e a aceitação da publicação (24 horas)
significa que um processo sistemático de revisão por pares não foi realizado
aqui, ou de má qualidade problemática. Fornecemos evidências convincentes
de várias inadequações, erros e falhas científicas.
Considerando as falhas científicas e
metodológicas aqui apresentadas, estamos confiantes de que o conselho editorial
da Eurosurveillance não tem outra escolha senão retratar a publicação.
Relatório de revisão conciso
Este artigo mostrará várias falhas graves no
artigo de Corman-Drosten, cujo significado levou a diagnósticos incorretos em
todo o mundo de infecções atribuídas ao SARS-CoV-2 e associadas à doença
COVID-19. Somos confrontados com bloqueios rigorosos que destruíram a vida
e os meios de subsistência de muitas pessoas, acesso limitado à educação e
essas restrições impostas por governos de todo o mundo são um ataque direto aos
direitos básicos das pessoas e suas liberdades pessoais, resultando em danos
colaterais para economias inteiras em um escala global.
Existem dez problemas fatais com o artigo de
Corman-Drosten, que iremos esboçar e explicar com mais detalhes nas seções
seguintes.
A primeira e principal questão é que o novo
Coronavírus SARS-CoV-2 (na publicação denominado 2019-nCoV e em fevereiro de
2020 denominado SARS-CoV-2 por um consórcio internacional de especialistas em
vírus) é baseado em sequências in silico (teóricas) , fornecido por um
laboratório na China [1], porque na época nem material de controle de
SARS-CoV-2 infeccioso (“vivo”) ou inativado nem RNA genômico isolado do vírus
estava disponível para os autores. Até o momento, nenhuma validação foi
realizada pela autoria com base em vírus SARS-CoV-2 isolados ou RNA completo do
mesmo. De acordo com Corman et al.:
“Nosso objetivo era desenvolver e implantar
metodologia de diagnóstico robusta para uso em ambientes de laboratório de
saúde pública sem ter material de vírus disponível.” [1]
O foco aqui deve ser colocado sobre os dois
objetivos declarados: a) desenvolvimento eb) implantação de um
teste de diagnóstico para uso em laboratórios de saúde
pública . Esses objetivos não são alcançáveis sem a
disponibilidade de qualquer material viral real (por exemplo, para determinar a
carga viral infecciosa). De qualquer forma, apenas um protocolo com
precisão máxima pode ser a meta obrigatória e primária em qualquer
cenário-resultado dessa magnitude. A determinação da carga viral crítica é
uma informação obrigatória, e é responsabilidade do grupo de Christian Drosten
realizar esses experimentos e fornecer os dados cruciais.
No entanto, essas sequências in silico foram
usadas para desenvolver uma metodologia de teste de RT-PCR para identificar o
vírus mencionado. Este modelo foi baseado na suposição de que o novo vírus
é muito semelhante ao SARS-CoV de 2003, pois ambos são beta-coronavírus.
O teste de PCR foi, portanto, projetado usando
a sequência genômica do SARS-CoV como material de controle para o componente
Sarbeco; sabemos disso por meio de nossa comunicação pessoal por e-mail
com [2] um dos co-autores do artigo de Corman-Drosten. Este método para
modelar o SARS-CoV-2 foi descrito no artigo de Corman-Drosten da seguinte forma:
“ o estabelecimento e validação de um
fluxo de trabalho de diagnóstico para triagem de 2019-nCoV e confirmação
específica, projetado na ausência de isolados de vírus disponíveis ou amostras
originais de pacientes. O design e a validação foram possibilitados pela
estreita relação genética com o SARS-CoV de 2003 e auxiliados pelo uso da
tecnologia de ácido nucleico sintético”.
A Reação em Cadeia da Polimerase com
Transcrição Reversa (RT-PCR) é uma importante tecnologia biomolecular para
detectar rapidamente fragmentos raros de RNA, que são conhecidos
antecipadamente. Na primeira etapa, as moléculas de RNA presentes na
amostra são transcritas reversamente para produzir cDNA. O cDNA é então
amplificado na reação em cadeia da polimerase usando um par de primers
específico e uma enzima DNA polimerase termoestável. A tecnologia é
altamente sensível e seu limite de detecção é teoricamente 1 molécula de
cDNA. A especificidade da PCR é altamente influenciada por erros de design
biomolecular.
O que é importante ao projetar um teste RT-PCR
e o teste RT-qPCR quantitativo descrito na publicação Corman-Drosten?
Para
ler o artigo completo clique aqui
Catálogo Resumido de Erros Encontrados no
Papel
O papel Corman-Drosten contém os seguintes
erros específicos:
1. Não existe nenhuma razão específica para
usar essas concentrações extremamente altas de primers neste protocolo. As
concentrações descritas levam ao aumento de ligações inespecíficas e
amplificações de produtos de PCR, tornando o teste inadequado como uma
ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.
2. Seis posições vacilantes não especificadas
introduzirão uma enorme variabilidade nas implementações de laboratório do
mundo real deste teste; a descrição inespecífica confusa no artigo de
Corman-Drosten não é adequada como um protocolo operacional padrão, tornando o
teste inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar
o vírus SARS-CoV-2.
3. O teste não pode discriminar entre o vírus
inteiro e fragmentos virais. Portanto, o teste não pode ser usado como
diagnóstico para vírus intactos (infecciosos), tornando-o inadequado como uma
ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2 e
fazer inferências sobre a presença de uma infecção.
4. Uma diferença de 10° C em relação à
temperatura de recozimento Tm para o par de primers1 (RdRp_SARSr_F e
RdRp_SARSr_R) também torna o teste inadequado como uma ferramenta de
diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.
5. Um erro grave é a omissão de um valor Ct no
qual uma amostra é considerada positiva e negativa. Esse valor de Ct
também não é encontrado em envios de acompanhamento, tornando o teste
inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o
vírus SARS-CoV-2.
6. Os produtos de PCR não foram validados em
nível molecular. Esse fato torna o protocolo inútil como uma ferramenta de
diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.
7. O teste de PCR não contém um controle
positivo único para avaliar sua especificidade para SARS-CoV-2 nem um controle
negativo para excluir a presença de outros coronavírus, tornando o teste
inadequado como uma ferramenta de diagnóstico específica para identificar o
SARS-CoV-2 vírus.
8. O projeto de teste no artigo de
Corman-Drosten é tão vago e falho que se pode ir em dezenas de direções
diferentes; nada é padronizado e não tem POP. Isso questiona
fortemente a validade científica do teste e o torna inadequado como uma
ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.
9. Muito provavelmente, o artigo de
Corman-Drosten não foi revisado por pares, tornando o teste inadequado como uma
ferramenta de diagnóstico específica para identificar o vírus SARS-CoV-2.
10. Encontramos graves conflitos de interesse
para pelo menos quatro autores, além do fato de que dois dos autores do artigo
de Corman-Drosten (Christian Drosten e Chantal Reusken) são membros do conselho
editorial da Eurosurveillance. Um conflito de interesses foi adicionado em
29 de julho de 2020 (Olfert Landt é CEO da TIB-Molbiol; Marco Kaiser é
pesquisador sênior da GenExpress e atua como consultor científico da TIB-Molbiol),
que não foi declarado na versão original (e ainda é ausente na versão
PubMed); A TIB-Molbiol é a empresa que foi “a primeira” a produzir kits de
PCR (Light Mix) com base no protocolo publicado no manuscrito Corman-Drosten e,
segundo suas próprias palavras, distribuíram esses kits de teste de PCR antes
que a publicação fosse mesmo submetido [20]; além disso, Victor Corman
& Christian Drosten não mencionou sua segunda afiliação: o laboratório
comercial de testes “Labor Berlin”. Ambos são responsáveis pelo
diagnóstico de vírus lá [21] e a empresa opera no domínio do teste de PCR em
tempo real.
À luz de nosso reexame do protocolo de teste
para identificar SARS-CoV-2 descrito no artigo de Corman-Drosten, identificamos
erros e falácias inerentes que tornam o teste de PCR SARS-CoV-2 inútil.
Conclusão
A decisão sobre quais protocolos de teste são
publicados e amplamente disponibilizados está diretamente nas mãos da
Eurosurveillance. A decisão de reconhecer os erros aparentes no artigo de
Corman-Drosten tem o benefício de minimizar muito o custo humano e o sofrimento
daqui para frente.
Não é do interesse da Eurosurveillance
retratar este documento? Nossa conclusão é clara. Diante de todas as
tremendas falhas e erros de projeto do protocolo PCR descritos aqui,
concluímos: Não há muita escolha no quadro de integridade e responsabilidade
científica.
Para
ler o artigo completo clique aqui
A fonte original deste artigo é Corman-Drosten Review Report
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